Какой светофильтр лучше использовать в световом микроскопе – Какой светофильтр лучше использовать в световом микроскопе — Уроки фотографии

Содержание

Какой светофильтр лучше использовать в световом микроскопе — Уроки фотографии

При замене лампы её необходимо очистить перед включением и нагревом.
Связано с тем, что пальцы оставляют следы на кварцевом стекле, тем самым снижая количество света, который проходит через конденсор.
Как узнать, достаточно ли освещения для работы с микроскопом? Включите весь свет. Если после этого вам придётся уменьшить яркость, то его достаточно!
Всем лампам низкого напряжения необходим нагрев в течение двух-трех минут.
Обычно, если вы включаете осветитель при самом низком напряжении, свет виден.
Затем выберите или подготовьте препарат, поместите его на столик и настройте фокусировку для объектива 10х — за это время лампа достаточно нагреется, чтобы можно было повысить напряжение до необходимого значения.
Не поднимайте напряжение выше необходимого. Это продлит срок службы лампы, что верно и для галогеновых ламп 6 В, 12 Вт стоимостью 10 или 12 $, и для ламп 12 В.
Хорошее правило для продления срока эксплуатации осветителя микроскопа: если вы отходите от микроскопа на достаточное время, чтобы лампа могла остыть, выключите осветитель.
ли времени для полного охлаждения лампы не хватит, снизьте напряжение до минимального, но не выключайте её.

Во время включения лампы, в первый момент, ток может в три раза превысить рабочий ток, то есть лампа 20 Вт может получить нагрузку 60 Вт, которая затем снизится до 20 Вт. Вы не можете отказаться от осветителя, однако избегайте включения и выключения его без необходимости.
Рассказывая об освещении, нельзя не упомянуть об освещении в отражённом или падающем свете. Такое освещение осуществляется от блока, помещённого между штативом микроскопа и бинокулярной насадкой и имеющего свой осветитель с низковольтной лампой и трансформатором, две ирисовые диафрагмы — полевую и апертурную, держатели светофильтров, дихроичное (светоделительное) зеркало.
Свет горизонтально падает на дихроичное (обычно полупрозрачное) зеркало, которое отражает его вниз через объектив (служащий одновременно и конденсором) на препарат, отражается от него и идет обратно вверх через объектив и зеркало на призмы, направляющие свет в бинокулярную насадку и окуляры.
С учётом характеристик микроскопа, описанных в предисловии, эпиосвещение необходимо в современном флуоресцентном микроскопе, о котором еще предстоит рассказать.

Источник: biologo.ru

Теоретические основы

Флуоресценция (иногда встречается написание «флюоресценция») — это физический процесс, при котором органические и неорганические вещества поглощают фотоны, испуская при этом новое излучение, но уже с другой длиной волны. Испускаемые фотоны имеют меньше энергии, чем поглощенные и, соответственно, имеют большую длину волны. При облучении веществ ультрафиолетом некоторые из них начнут светиться, но цвет этого свечения будет направлен в сторону красной части спектра.

Явление флуоресценции было открыто в Англии в середине XIX века. Дальнейшие исследования показали, что при облучении ультрафиолетом флуоресцировать начинают многие вещества: витамины, полезные ископаемые, масла, хлорофил, кристаллы. До определенного момента научные знания не применялись на практике. Лишь в 30-х годах ХХ века биологи начали окрашивать клетки, бактерии и другие микрообъекты веществами, вызывающими свечение. В это же время был сконструирован и первый флуоресцентный микроскоп.

Использование флуоресценции оказалось настолько эффективным, что дало возможность исследовать частицы с разрешением до 1-10 нм. Эту технологию было бы правильнее называть наноскопией, так как она позволяет «раскладывать» объекты вплоть до отдельных молекул. 

Как правило, флуоресцентные (люминесцентные) микроскопы работают в отраженном свете. Главная задача при использовании эффекта флуоресценции заключается в отделении слабого светового потока, излучаемого объектом, от сильного излучения подсветки. Для большей наглядности изображение, предназ

urokifoto.com

Светофильтры для микроскопа

Микроскопические исследования требуют использования разных агрегатов и дополнительных аксессуаров к устройствам. Одним из таких является светофильтр (СФ). Его применяют не только для визуальных исследований и наблюдений за объектами через увеличительное стекло окуляра микроскопа, но также и для создания микроскопических фотографий частиц препаратов.

Зачастую светофильтры сделаны из:

  • — матовых,
  • — нейтральных
  • — разноцветных стекол,

благодаря им можно избирательно снизить или вовсе заблокировать интенсивность конкретной световой волны, пропуская при этом другие волны. Благодаря светофильтрам в лабораторных условиях можно компенсировать разные отклонения и искажения в картинке, которую мы получаем на оптическом устройстве, а также минусы осветительной системы, и при этом получить на выходе наиболее четкое, качественное изображение. При этом, важно не забывать о том, что когда в оптических приборах вводят лучи дополнительных элементов, в частности светофильтрацию, это приводит к тому, что фильтр поглощает световой поток и как следствие, уменьшает освещенность образца на препаратном столе. Это может отрицательно повлиять на качество картинки, которую отобразит микроскоп. Поэтому, подбирая светофильтры, нужно устанавливать эти дополнительные аксессуары лишь в том случае, если они

действительно (!) необходимы и могут принести пользу в исследованиях.

Основная сборка любого оптического прибора включает несколько фильтров света. Зачастую исследователи сталкиваются с голубым, желтым, зеленым и матовым фильтрами

.

В этой статье мы попробуем разобраться, в каких же ситуациях и как следует использовать эти аксессуары, и как они реально могут помочь в анализе препарата или образца.

Голубой светофильтр

Итак, синий фильтр света, который также иногда бывает голубым, сравнивается с дневным светом, может принести пользу при использовании в микроскопах, где образец на предметном столе освещается при помощи вольфрамовой лампы, или галогенки. В этом случае синий СФ гарантирует баланс передачи оттенков и придает картинке холодный, естественный цвет, как будто бы образец освещен обычным естественным, дневным светом. Это более четкий и комфортный для глаз вариант, так как он позволяет точно увидеть изображение без искусственного жёлтого освещения.

Галогеновые лампы и лампы накаливания в свою очередь могут менять оттенок в более теплую или холодную сторону, в зависимости от того, насколько интенсивно освещение образца на предметном столике. При этом, Если вы будете использовать светодиодное освещение, то не столкнетесь с таким недостатком. Если интенсивность освещения будет слабой, лампа будет давать красный оттенок, а если сильной — то голубой, что может в свою очередь несколько исказить цвета. Это очень весомый недостаток для тех, кто занимается микрофотографией. В результате готовые фотоснимки не отображают реальных цветов объекта изучения, и зачастую отличаются усиленными желтыми тонами, как правило, фоновыми.

Если же над линзой или в держателе фильтра конденсора в биологическом агрегате установить синий СФ, он поможет сдержать красную часть спектра, благодаря чему микроскоп покажет более естественные цвета на готовом изображении.

Создавая микроскопические фотографии, нужно не забывать о правильной передаче тонов, заблаговременно настроив баланс белого. Это делается точно по такому же принципу, как и в любом современном фотоаппарате.

Чтобы привести пример, отметим, что тонкий голубой фильтр света может увеличить температуру оттенка на 200 градусов, благодаря чему при изучении окрашенных тканей или гистологических срезов под микроскопом, появляется возможность увидеть наиболее четкое в микрофото с правильной передачей всех оттенков.

Зелёный светофильтр

Он также носит название интерференционного. Его особенности в том, что он чаще всего применяется в лабораторных микроскопах, оснащенных ахроматическими объективами. В них сферические отклонения от нормы лучше всего исправляют при помощи зелёного оттенка. Так, СФ позволяет не только улучшить четкость картинки, строящейся формируется в объективе, но также и получить микроснимок наиболее высокого качества благодаря особой конструкции фазово-контрастных объективов. На снимках будет отображена высокая контрастность при наблюдениях в зелёном поле. Хотя при этом анализ фазово-контрастных микроскопов показал, что в исследованиях могут также быть полезны и иные СФ, например, голубой или желтый.

Диффузор, или так называемый «матовый» светофильтр

Его применяют в микроскопе для того, чтобы добиться большего рассредоточения световой волны и при необходимости настройки диффузного, рассеянного света. Этот СФ, также как и синий, чаще всего применяют тогда, когда освещение образца на предметном столике достигается за счёт лампы накаливания. Также данный аксессуар может сослужить хорошую службу в ходе работы с объективами, которые не во много раз увеличивают предмет.

Матовый фильтр может применяться в роли дополнительной линзы и равномерно освещать весь объект наблюдения.

Желтый светофильтр

Его применяют для того, чтобы лучше всего настроить баланс цветов в устройствах, в которых свет источают галогеновые или лампы накаливания для создания цветных микрофотоснимков. Благодаря желтому фильтру снижается общая температура картинки, также этот аксессуар используется в ходе исследований через металлографические модели. Он позволяет заметить небольшие дефекты в структуре металлических образцов или их поверхностей.

Нейтральный светофильтр

Его зачастую используют для того, чтобы настроить время экспозиции. Чаще всего он необходим во время рабочего процесса с камерой, в которой стандартная выдержка затвора. Нейтральный СФ уменьшает яркость света в том случае, если его слишком много для того, чтобы удобно производить наблюдение или делать фотографии. Его тон — серый, благодаря чему достигается снижение яркости проходящего светового потока на отдельном участке или на всей длине светового луча, при этом, не изменяя оттеночную температуру.

Существует два вида таких светофильтров — одни из них абсорбируют свет, другие — отражают.

Светофильтры для окрашенных предметов

Образцы тканей человека, разные био-микрочастицы нередко окрашиваются специальными органическими средствами, так как это позволяет более четко увидеть эти элементы в структуре объекта. Для того, чтобы рассмотреть окрашенные частицы, лучше всего использовать компенсационный светофильтр, который в восстанавливает почти все утраченные оттенки на цветном фото. Иногда некоторые цвета могут быть блеклыми, в том случае, если они подверглись нескольким окраскам, именно тут на помощь придет соответствующий СФ.

Кроме того, окрашенные ткани на картинке микроскопа нередко бывают отображены недостаточно насыщенными и мутными, что помогает нейтрализовать дидимиевый СФ, сделанный из специального стекла. Например, светло-красный вариант дидимия включает неодим и празеодим, отлично поглощающие свет. Эти элементы присутствуют в СФ в разных долях и гарантируют приглушение всех оттенков, кроме узкой части видимого света, например, красной. В целом, эти фильтры не придают изображению насыщенности, а напротив — делают все цвета более приглушенными, кроме одного, выделяя его на фоне остальных.

Также есть так называемые поляризационные модели фильтров, поляризатор и анализатор, которые позволяют проводить анализ посредством поляризованного освещения.

Флуоресцентная версия светофильтра являет собой узкополосный фильтр, который позволяет поглотить свечение луча и защитить глаза лаборанта. Таким образом, он может видеть лишь ту часть образца, которая светится — флуоресцирует. Но об этом мы поговорим более детально в наших следующих статьях.

podmikroskopom.ru

Назначение светофильтров в микроскопах — типы цветных фильтров — принцип действия

Вернуться к списку Задать свой вопрос

 

 

Для школьников и студентов, желающих углубленно изучать методики микроскопии, необходимо в совершенстве освоить все возможности наблюдательного прибора, задействовать на 100% предусмотренные функции. В этом обзоре мы расскажем о назначении светофильтров в микроскопах, правильное использование которых существенно повышает результат исследований (простых и сложных). Отметим, их применение не обязательно на школьном уровне, но они окажутся полезными для начинающих биологов и медиков, решившими начать серьезное качественное обучение.

Светофильтры – это вспомогательные элементы оптической системы, выделяющие определенный спектр в видимом спектральном диапазоне и корректирующее первоначальное изображение. На основе зрительных ощущений человек глазами фиксирует широкую цветовую гамму с тысячами оттенков (так же устроены и светочувствительные CMOS матрицы цифровых окулярных камер). Но фильтр «отсекает» некоторые волны электромагнитного излучения, оставляя только один тип – конкретного спектрального состава. Другими словами, применяя фильтрацию, тон изображения препарата будет преимущественно одноцветным. И за счет этого резко улучшается контрастность.

Следовательно, свето-фильтрация позволит заметить множество новых нюансов исследуемого объекта, т.к. детализация его мельчайших структур возрастает, блики минимизируются. Монохромность цвета в разы облегчает восприятие микроскопических частиц органами зрения.

Светофильтры в микроскопах имеют форму круглых пластинок. Из-за однотонности они пропускают волны только ограниченной длины:

Желтый: 565-590 нанометров; Понизит интенсивность и мощность волнового распространения («цветовую температуру»).  Рекомендован для микрофотографии.

Зеленый: 500-565; В большинстве лабораторных медицинских моделях револьвер оснащен ахроматическими объективами (реже – планахроматическими). В обоих случаях их реальная разрешающая способность и исправление сферических аберраций наиболее успешно проявляется именно в зеленом спектре. Также рекомендуется вставлять этот фильтр при микроскопировании в люминесценции и методом фазового контраста.

Синий: 440-485.  Целесообразно применить в микроскопах с галогенной подсветкой, если требуется немного «охладить» мягкое свечение лампы. Он создает эффект «дневного света» (сопоставимого с ярким светодиодом).

Нейтральный и матовый — снижают насыщенность и яркость. Меняют пространственное распределение света, давая равномерность по всему полю визуализации.

Устанавливаются на конденсор Аббе в гнездо откидного механизма между асферической и конденсорной линзой, или перед ними. Далее делается настройка освещения. На предметный столик положите микропрепарат, вращением микровинта добейтесь четкой фокусировки, и раскройте полевую диафрагму до краев поля зрения.

В детской микроскопии роль простейшего конденсора отведена вращающемуся диску с диафрагмами, в часть которых вмонтированы цветные стекла. В данном варианте контрастирование и смена тона проводится поворотом этого круга и выставлением нужного размера и цвета.

 

 

oktanta.ru

Как работать со световым микроскопом


С этим файлом связано 51 файл(ов). Среди них: KURS_NA_NEREST.pdf, MBK-2018_IP1.pdf, Informatsionnoe_pismo.pdf, Aktualnye_problemy_biologii_i_ekologii_molodyozh_2018.pdf, Irkutskiy_universitet.pdf, Polozhenie_o_fotokonkurse_2017.docx, chern_kn_fl_sibiri_2016.pdf и ещё 41 файл(а).
Показать все связанные файлы
1   2   3   4   5   6   7   8   9 Светофильтры
_________________________________________________________________________________________________________________________
Как уже говорилось ранее, светофильтр обычно устанавливается в выдвижной держатель под конденсором или иногда после коллекторной линзы осветителя.
В микроскопии применяются стеклянные цветные, нейтральные и матовые светофильтры (диффузоры). Синие светофильтры используются с вольфрамовыми лампами для получения эффекта дневного света, который приятнее для глаз, чем нескорректированный жёлтый свет. Галогеновые лампы дают свет ближе к белому, поэтому с ними можно использовать более тонкие синие светофильтры. Для фазового контраста предназначен зелёный светофильтр, однако, согласно недавним исследованиям, могут быть полезны и светофильтры других цветов. О применении цветных светофильтров в микрофотографии будет рассказано позднее.
Помните от светофильтров должна быть реальная польза. Если же ее нет — устанавливать их не нужно. Любой дополнительный элемент в оптическом ходе лучей поглощает свет, а недостаток освещения всегда создаёт проблемы при работе с микроскопом.


________________________________________________________________________________________________________________________
Лампы и осветители
_________________________________________________________________________________________________________________________
Сейчас сложно найти микроскоп без встроенного осветителя. Поэтому мы даже не будем обсуждать, как выровнять зеркало по отношению к настольной лампе (см. примечания о стереомикроскопах).
В лампах 6 и 12 В обычно есть нить накала, которая проходит через всю лампу.
Иногда нить имеет форму «V», что более эффективно для работы с микроскопом. Но при использовании любой из нитей необходим матовый светофильтр, чтобы свет, проходящий через конденсор, ровно освещал все поле зрения.
Для лампы низкого напряжения, 6 и 12 В, требуется трансформатор для снижения напряжения в сети и регулировки напряжения с целью изменения интенсивности освещения.
Светящееся тело лампы накаливания представляет собой тонкую ленту или плотно навитую спираль из тонкой проволоки. В большинстве случаев эти лампы дают неравномерное освещение и часто требуют применения матового стекла. Это стекло может быть выведено из хода лучей при использовании 40-кратных объективов и выше, что позволяет посылать в конденсор больше света. Иногда при использовании 40-кратного объектива в поле зрения микроскопа наряду с изображением препарата видны нити накала лампы. В этом случае также целесообразно применять матовое стекло.
В лампах накаливания светящимся телом обычно является вольфрамовая нить, находящаяся в вакуумной стеклянной колбе. При работе в результате нагревания нить выделяет пары металла — вольфрама, которые осаждаются на внутренних стенках колбы, приводя к уменьшению светового потока.
Большинство ламп низкого напряжения — галогеновые лампы. Они имеют такую же вольфрамовую нить, выделяющую пары металла, которые взаи- модействуют с парами йода и оседают на нити. Благодаря этому внутренняя поверхность лампы остаётся чистой, а яркость — постоянной на всем протяжении срока эксплуатации лампы. Однако взаимодействие паров увеличивает давление внутри лампы, поэтому лампа изготовлена из кварцевого стекла.


При замене лампы её необходимо очистить перед включением и нагревом.
Связано с тем, что пальцы оставляют следы на кварцевом стекле, тем самым снижая количество света, который проходит через конденсор.
Как узнать, достаточно ли освещения для работы с микроскопом? Включите весь свет. Если после этого вам придётся уменьшить яркость, то его достаточно!
Всем лампам низкого напряжения необходим нагрев в течение двух-трех минут.
Обычно, если вы включаете осветитель при самом низком напряжении, свет виден.
Затем выберите или подготовьте препарат, поместите его на столик и настройте фокусировку для объектива 10х — за это время лампа достаточно нагреется, чтобы можно было повысить напряжение до необходимого значения.
Не поднимайте напряжение выше необходимого. Это продлит срок службы лампы, что верно и для галогеновых ламп 6 В, 12 Вт стоимостью 10 или 12 $, и для ламп 12 В.
Хорошее правило для продления срока эксплуатации осветителя микроскопа: если вы отходите от микроскопа на достаточное время, чтобы лампа могла остыть, выключите осветитель. Если времени для полного охлаждения лампы не хватит, снизьте напряжение до минимального, но не выключайте её.
Во время включения лампы, в первый момент, ток может в три раза превысить рабочий ток, то есть лампа 20 Вт может получить нагрузку 60 Вт, которая затем снизится до 20 Вт. Вы не можете отказаться от осветителя, однако избегайте включения и выключения его без необходимости.
Рассказывая об освещении, нельзя не упомянуть об освещении в отражённом или падающем свете. Такое освещение осуществляется от блока, помещённого между штативом микроскопа и бинокулярной насадкой и имеющего свой осветитель с низковольтной лампой и трансформатором, две ирисовые диафрагмы — полевую и апертурную, держатели светофильтров, дихроичное (светоделительное) зеркало.
Свет горизонтально падает на дихроичное (обычно полупрозрачное) зеркало, которое отражает его вниз через объектив (служащий одновременно и конденсором) на препарат, отражается от него и идет обратно вверх через объектив и зеркало на призмы, направляющие свет в бинокулярную насадку и окуляры.
С учётом характеристик микроскопа, описанных в предисловии, эпиосвещение необходимо в современном флуоресцентном микроскопе, о котором еще предстоит рассказать.


Конечно, падающий свет используется также в металлографических и промышленных микроскопах для исследования чипов интегральных схем, в минералогических поляризационных микроскопах и др. все они будут кратко описаны далее.
Осталось обсудить два понятия перед тем, как мы перейдём к освещению по
Кёлеру.


________________________________________________________________________________________________________________________
Парфокальность
_________________________________________________________________________________________________________________________
Этот термин означает сохранение препарата резким при переходе от одного объектива к другому.
Истинная парфокальность определяется как необходимость поворота винта точной фокусировки не более чем на 1/4 полного оборота при постепенном снижении увеличения — от сухого объектива 100х (очень осторожно сфокусированного без применения иммерсионного масла) к 40х, затем к 10х и 4х.
Причина перехода от объективов с высоким увеличением к объективам с низким часто заключается в различии глубины резкости. Объектив 100х дает очень маленькую глубину резкости и фокусируется на самой поверхности препарата.
Глубина резкости объектива 40х превышает её более чем в два раза. Глубина резкости объектива 10х — более чем в 4 раза выше и т. д.
Если для фокусировки при переходе от одного объектива к другому необходимо более 1/4 поворота винта точной фокусировки, то или вы используете обычный недорогой микроскоп, или он неправильно настроен.
Для настройки парфокальности можно использовать вкладыши для удлинения объективов. Однако правильнее это делается путём подрезки объетивов (плоскости посадки) так, чтобы после этой процедуры получилась оптимальная парфокальность.
Для этой и других целей у хорошего поставщика микроскопов должен быть токарный станок (например, для изготовления детали, которая больше не предоставляется производителем).


________________________________________________________________________________________________________________________
Центрировка
_________________________________________________________________________________________________________________________
Термин означает сохранение клетки или другой детали препарата в центре поля зрения микроскопа при повышении увеличения после центрирования при низком увеличении.
Мы ранее утверждали, что можно установить объектив, изготовленный по стандарту DIN, от одного микроскопа на другой DIN микроскоп, при этом они будут парфокальны и центрированы.
Разумеется, надо учитывать и цену. При установке объектива с микроскопа
Nikon на Olympus или наоборот парфокальность и центрировка будут превосходными, при установке на Zeiss или Leitz — очень хорошими.
Автор все ещё помнит объективы без пружинящих оправ, наборы объективов с разницей фокальной длины в 5-6 мм и очень плохой центрировкой. Современный микроскоп со всеми своими недостатками и несоответствиями, значительно проще в применении, чем микроскопы, которые были 25 лет назад, и часто значительно лучше.
До сих пор мы рассматривали только светлопольную микроскопию. Перед тем как перейти к обсуждению различных методов и специализированных микроскопов, нужно подробно изучить освещение по Кёлеру.


________________________________________________________________________________________________________________________
Настройка освещения по Кёлеру
_________________________________________________________________________________________________________________________
Настройка освещения по Кёлеру — простая процедура настройки микроскопа и его компонентов для получения наилучшего возможного сочетания контраста и разрешения. У человека, знакомого с этой процедурой, длительность настройки составляет не более двух-трех минут. Её следует проводить каждый день.
Предположим, что осветитель включён, прогрет и бинокулярная насадка настроена, то есть расстояние между окулярами выставлено.
Поместите знакомый препарат на предметный столик и настройте фокусировку при использовании объектива 10х. Апертурная и полевая диафрагмы должны быть широко открыты, светофильтр и дополнительная линза выдвинуты из оптического пути, конденсор поднят до упора и затем опущен на расстояние примерно 0,5 мм.
Прикройте полевую диафрагму так, чтоб её было видно в поле зрения, и настройте фокусировку конденсора, чтобы в фокусе оказался внутренний край ирисовой диафрагмы в плоскости препарата. Когда она будет в фокусе, поставьте её изображение в центр поля зрения и откройте её так, чтобы наружный диаметр находился несколько за пределами поля зрения. Вытащите один окуляр, и глядя в пустой тубус, прикройте апертурную диафрагму, оставив открытыми 2/з в центре наблюдаемого при этом поля. Верните на место окуляр. Настройка освещения по
Кёлеру завершена.
Вы начали с объектива 10х. Препарат должен оставаться в фокусе при любом методе настройки и при любых регулировках.
Теперь обратимся к осветителю. Нить лампы должна находиться на расстоянии минимум 7″ (предпочтительно 10″) от апертурной диафрагмы. Осветитель располагается позади микроскопа. Среднюю позицию занимает полевая диафрагма, затем зеркало для отражения света под углом 90° на конденсор. Если нить находится на оптимальном расстоянии, то она будет в фокусе в плоскости апертурной диафрагмы; в противном случае её необходимо сфокусировать в этой плоскости путём передвижения по горизонтали коллекторной линзы осветителя. Закрыв полевую диафрагму, можно посмотреть, центрирована лампа или нет (если нет, её нужно центрировать).

Следует проверить настройку конденсора для данного препарата, фокусирует ли конденсор полевую диафрагму в поле зрения. Для этого, при прикрытой полевой диафрагме перемещением конденсора по вертикали подкорректируйте её фокусировку в плоскости препарата. Затем полевая диафрагма раскрывается до краёв поля зрения. Следовательно, при применении разных объективов ее раскрытие будет различным. Таким образом, название «полевая диафрагма» отражает её назначение.
Поясним выражение «настройка конденсора для данного препарата». Конденсор устанавливается в положении на 0,5 мм ниже столика по двум причинам: 1) если мы не сможем пройти фокальную точку, как мы узнаем, что мы её нашли?; 2) показатель преломления воздуха равен 1,0. Если мы оставим воздух между поверхностью конденсора и нижней поверхностью предметного стекла, то вся система освещения будет работать с А = 1,0. Однако апертура конденсора должна быть равна 1,25, как и
А иммерсионного объектива 100х. Как сделать так, чтобы система работала с А =
1,25, а не с А = 1,0? Ответ: поместите на конденсор каплю иммерсионного масла и подведите его к нижней части предметного стекла. Тогда у вас будет достаточно места для капли масла и конденсор установится в правильном положении. Вы когда- нибудь наносили масло между конденсором и предметным стеклом? Скорее всего, нет. Почему? Потому что у вас не было в этом необходимости. Вы и без того видели всё, что нужно. Значит ли это, что иммерсионный объектив 100х с А = 1,0 или даже
А = 0,95 в сочетании с конденсором с А = 1,0 даёт нормальный результат? Именно так.
Рассмотрим масляную иммерсию — как и почему она применяется. Все иммерсионные объективы, предусматривающие наличие масла, используют масло типа А. После фокусировки с объективом 40х поверните револьвер так, чтобы убрать объектив с оптического пути, и нанесите одну или две капли иммерсионного масла на участок покровного стекла, через который проходит свет. Затем установите объектив 100х.
Рис. 8. Освещение по Кёлеру


Поскольку микроскоп парфокален, нет опасности повредить покровное стекло.
При необходимости подстройте фокусировку конденсора. Вы можете настроить фокусировку для объектива 100х без использования масла на конденсоре, а просто при помощи правильной настройки апертурной диафрагмы и яркости освещения.
В чем преимущество использования масла? Оно позволяет устранить рас- сеянный свет, вызванный освещением в комнате, что влияет на контраст изображения препарата. Второе и главное преимущество — обеспечивает лучший сбор лучей света, выходящих из конденсора, и соответствующее повышение яркости изображения.
Увеличивает ли использование масла разрешающую способность микроскопа?
Вероятно нет, хотя благодаря устранению размытости мы видим препарат с надлежащим контрастом при правильном применении апертурной диафрагмы. (Это предположение автора неверно. Иммерсионное масло позволяет увеличить апертуру объектива, что, в свою очередь повышает разрешающую способность микроскопа. —
Прим. ред.)
Другими словами, мы теперь используем апертурную диафрагму только для того, для чего она предназначена, — регулировки контраста.
Рабочее расстояние обычного объектива 100х составляет около 0,3 мм.
Иммерсионное масло типа А хорошо подходит для данного расстояния и благодаря высокой вязкости легко счищается со стекла и объектива. Масло типа Б гуще и предназначено для конденсоров, потому что иногда расстояние между конденсором и стеклом должно составлять 0,5 мм или более. Оба типа масла высыхают медленно или не высыхают совсем за то время, пока вы используете их. Не забывайте очистить объектив перед тем, как закончить работу, даже если вы собираетесь отойти всего на
10 минут.
Теперь посмотрим, что зависит от того, левша вы или правша. При выводе объектива 100х из оптического пути для его чистки — 40х или с низким увеличением оказывается в оптическом ходе? Если это объектив 40х — то поменяйте порядок объективов: объектив 40х довольно длинный и задевает масло, однако его линза не предназначена для работы с ним.
Микроскоп позволяет поворачивать револьвер с объективами и по часовой стрелке, и в противоположном направлении. Поэтому, если вы единственный

пользователь микроскопа, выберите тот порядок, который вам удобен для очистки иммерсионного объектива.
Две самые большие проблемы при чистке микроскопа — масло и грязь на объективах 40х и 100х. Масла на объективе 40х не должно быть, но вы можете не обратить на это внимание; также вы можете не заметить масляную плёнку и грязь на объективе 100х, поскольку фронтальная линза очень маленькая.
Фронтальная линза иммерсионного объектива герметично закрыта с краев для предотвращения попадания масла в объектив и на внутреннюю поверхность самой линзы. Наличие масла внутри объектива исключает возможность нормальной работы, а очистка стоит дорого.
Теперь повторно обратимся к освещению по Кёлеру.
Поместите знакомый препарат на столик и настройте фокусировку при использовании объектива 10х. Апертурная и полевая диафрагмы должны быть широко открыты, светофильтр и вспомогательная линза выдвинуты из оптического пути, конденсор поднят до упора. Прикройте полевую диафрагму так, чтобы ее было видно, и настройте фокусировку конденсора, таким образом, чтобы в фокусе оказался внутренний край ирисовой диафрагмы на плоскости препарата. Когда она будет в резком фокусе, откройте её, так, чтобы край находился как раз за полем зре- ния. Вытащите один окуляр и, глядя в пустой тубус, прикройте апертур- ную диафрагму, оставив открытыми 2/3 в центре поле зрения. Верните на место окуляр.
Проверьте, чему равна апертура объектива 40х. Обычно она равна 0,65.
Значение очень близко к 2/3 апертуры конденсора. Поэтому мы настраиваем микроскоп, используя объектив 10х, что подходит также и для работы с объективом
40х. Последний называют сухим объективом с высоким увеличением. Сейчас уже есть сухие объективы 60х, 80х и даже 100х, однако термин «сухой объектив» по- прежнему относится к объективу 40х. Причина использования объектива 10х для настройки в том, что у него самое низкое увеличение среди хорошо скоррегированных объективов высокого качества. Объективы с увеличением меньше
10х хуже, вне зависимости от производителя.
Некоторые микроскопы имеют название «микроскоп типа Кёлера» или «полу-
Кёлер». Если лампа находится прямо под конденсором и нет необходимого расстояния 7″ — 10″, такие приборы не относятся к микроскопам по Кёлеру. Если есть

полевая диафрагма, её можно использовать для ограничения освещённого поля, но не для настройки конденсора.
Можно ли провести настройку освещения по Кёлеру для такого микроскопа? не совсем, но попробуйте. Поместите знакомый препарат на предметный столик и настройте фокусировку при использовании объектива 10х. Апертурная диафрагма должна быть широко открыта, светофильтр и вспомогательная линза выдвинуты из оптического пути. Переместите конденсор до упора и опустите на 0,5 мм. Вытащите один окуляр и, глядя в пустой тубус, прикройте апертурную диафрагму, так, чтобы открыто было 2/3 в центре поле зрения. Верните на место окуляр. Если есть полевая диафрагма, широко откройте её. После настройки закрывайте её до тех пор пока поле зрения не начнёт становиться тёмным. Теперь поднимите или опустите конденсор, чтобы проверить, подходит ли расстояние 0,5 мм для данного препарата. Очень велика вероятность, что вам редко, если вообще придется работать с микроскопом типа Кёлера. Поэтому научитесь настраивать микроскоп до компромиссного варианта, но так близко к идеалу, как только возможно.
Когда вы освоите работу с микроскопом и научитесь пользоваться всеми его компонентами, вам потребуется две—три минуты на настройку по Кёлеру или полу-
Кёлеру. Вы сможете открывать апертурную диафрагму примерно на 2/3, просто глядя на препарат.
Фокусировку конденсора следует выполнять для конкретного препарата, и это единственная причина для изменения положения конденсора после настройки освещения по Кёлеру или полу-Кёлеру (на 0,5 мм ниже стекла).
Представьте себе, что выбраны для работы объектив и окуляр, конденсор установлен в нормальное положение, которое редко требуется менять, и все компоненты чистые. Что вам остаётся делать? Вы настроили апертурную диафрагму для объектива 40х, но можете выбрать объектив 10х или даже с меньшим увеличением или, напротив, объектив 100х. Апертурная диафрагма — единственный регулируемый компонент микроскопа. Ваша компетенция при работе с микроскопом зависит исключительно от того, насколько хорошо вы умеете настраивать апертурную диафрагму. Отверстие в 2/3 — это нормальное положение. Врач- лаборант при работе примерно каждые 4 минуты достаёт окуляр и проверяет поло- жение диафрагмы.


Рутинное исследование и техническая подготовка препаратов ткани в лабораториях, больницах, клиниках проводятся препаратором. Он готовит препараты с клетками и растворы. Сложные препараты смотрит патолог (врач-лаборант со специализацией в области цитологии и гистологии). При исследовании препарата он должен понять, вызваны ли затруднения в работе: (1) неправильной фиксацией объекта в формальдегиде, (2) сжатием ткани микротомом, (3) разрыванием ткани ножом, (4) неправильным окрашиванием и т. д. или (5) неправильной работой микроскопа. Поэтому патолог часто проверяет правильность настройки микроскопа по Кёлеру, чтобы исключить неполадку микроскопа как причину проблемы.

biologo.ru

Световые микроскопы и их виды

Световой микроскоп – это оптический прибор, позволяющий получить увеличенное изображение трудноразличимых невооруженным глазом или вообще невидимых объектов (либо деталей их структуры). В общем случае микроскоп состоит из штатива, предметного столика и подвижного тубуса с окуляром и объективом. Современные приборы оснащаются также специальной осветительной системой.

Микроскопы широко используются в самых разных отраслях промышленности, в области образования и науки, для проведения экспертиз. В зависимости от своего предназначения и конструктивных особенностей световые микроскопы подразделяются на металлографические, биологические, криминалистические, люминесцентные, поляризационные, инвертированные, стереомикроскопы и моновидеомикроскопы.

Биологические микроскопы

Наиболее знакомы обывателю биологические микроскопы. Их также называют лабораторными, медицинскими, микроскопами проходящего света и плоского поля. Их предназначение – изучение прозрачных и полупрозрачных объектов. Лабораторные микроскопы особенно широко применяются в различных областях биологии (ботанике, микробиологии, цитологии) и медицины, а также – в археологии, микроэлектронике, пищевой промышленности, геологии и т. д. Подобные устройства могут оснащаться или дополнительно комплектоваться специальными аксессуарами, насадками, светофильтрами, наборами объективов и окуляров, цифровыми фото- и видеокамерами.

Люминесцентные микроскопы

При работе люминесцентных микроскопов используются свойства флюоресцентного излучения, то есть способность некоторых объектов и красителей испускать свечение при облучении их ультрафиолетом или другими коротковолновыми лучами света.

Люминесцентный микроскоп снабжен мощным источником освещения с большой поверхностной яркостью, максимум излучения которого находится в коротковолновой области видимого спектра, системой светофильтров, а также интерференционной светоделительной пластинкой, применяемой при возбуждении люминесценции падающим светом. В современных люминесцентных микроскопах применяются специальные флюоресцирующие или ферментные метки, за счет чего удалось существенно уменьшить размеры оборудования. Подобные приборы особенно эффективны при исследованиях крови, клеток костного мозга, антигенных анализах.

Стереомикроскопы

Стереомикроскопы позволяют получать объемное изображение исследуемого объекта за счет наличия у него не одного, а сразу двух объективов, расположенных под углом. Стереомикроскопы обладают существенно большей глубиной резкости по сравнению с обычными микроскопами плоского поля. За счет наличия таких свойств подобные устройства могут эффективно использоваться в ряде областей промышленности, к примеру – в ювелирном деле. Помимо стандартных стереомикроскопов, получили распространение и цифровые модели.

Криминалистические микроскопы 

Криминалистические микроскопы предназначены для одновременного сравнительного анализа двух объектов. Подобные экспертизы позволяют выявить идентичность таких предметов, как волосы, гильзы, пули, волокна, нитки, ткани и пр. Для исключения возможных ошибок сегодня широко применяется дополнительное цифровое оборудование и программное обеспечение. Криминалистические микроскопы могут использоваться в комплексе с фото- и видеокамерами и персональными компьютерами.

Металлографические микроскопы

Металлографические микроскопы предназначены для изучения структуры поверхности непрозрачных материалов, в первую очередь металлов и сплавов. Подобные исследования производятся в отраженном свете. Для получения желаемого эффекта используются специальные системы линз и зеркал. Металлографические микроскопы по своей конструкции могут быть прямыми или инвертированными, а также портативными. Наиболее эффективными являются современные цифровые модели, позволяющие производить максимально точные исследования поверхности изучаемых объектов. Подобные приборы применяются в металлургии, машиностроении, археологии, геологии и т.д.

Поляризационные микроскопы

Поляризационные микроскопы относятся к наиболее сложным в технологическом плане типам оптического оборудования. Они используются для исследования материалов, обладающих нестандартными (анизотропными) оптико-кристаллическими свойствами. В процессе работы формируется поляризованный световой поток, который облучает изучаемый образец. Поляризованные микроскопы наиболее широко применяются в минералогии, кристаллографии, петрографии, а также при проведении гематологических, гистологических и других медицинских и микробиологических исследований.

Инвертированные микроскопы

Инвертированные микроскопы отличаются тем, что их объективы находятся под исследуемым предметом. Это позволяет работать с достаточно большими по своему объему объектами, а также использовать специальную лабораторную посуду и инструменты. При этом инвертированные микроскопы могут быть биологическими, люминесцентными, металлографическими и пр. Подобные приборы широко используются при различных научных и лабораторных исследованиях в микробиологии, медицине, машиностроении, микроэлектронике и т.д.

Моновидеомикроскопы 

Моновидеомикроскопы предназначены для получения видеоизображения наблюдаемых объектов с возможностью вывода на экран, записи и последующего анализа информации. При этом конструктивно устройство является объективом для камеры. Для эффективной работы моновидеомикроскопы можно дополнительно комплектовать необходимыми аксессуарами (предметными столами, линзами, фильтрами, осветителями, адаптерами).

altami.ru

О флуоресцентном микроскопе — Микросистемы

Принцип работы

Флуоресцентный микроскоп — оптический прибор, показывающий в увеличенном виде клетки, поверхности и частицы с флуоресцирующими красителями. Схематично механизм флуоресценции выглядит так: При облучении флуоресцирующего вещества (ФВ) светом с определенной длиной волны (частотой) электроны ФВ поглощают квант света, приобретают дополнительную энергию и переходят на более высокую орбиту. Электроны не могут долго оставаться в возбужденном состоянии на более высокой орбите и возвращаются на ранее занимаемую. При этом излишек энергии выпускается также в виде кванта света, но с меньшей энергией (частотой) или, соответственно, большей длиной волны. Часть энергии тратится на так называемую релаксацию. Разность длин волн возбуждающего и испускаемого света является основополагающим принципом наблюдений в флуоресцентной микроскопии.

 

Детектирование флуоресценции широко применяется в разных областях науки и является одним из самых чувствительных методов неразрушающего контроля. С помощью флуоресценции можно определить содержание всего одной молекулы связанной с флуорофором. Если в образце несколько флуорофоров, то для их детектирования используют узкополосные (с разным диапазоном волн), либо широкополосные блок-фильтры. При всех своих возможностях, флуоресцентный метод имеет и ограничения, так, например, не всегда можно подобрать фильтры так, чтобы исследовать отдельные флуорофоры (флуорохромы) в образце, если диапазоны длин волн их возбуждения пересекаются.

Подбирая фильтры для своих исследований, обратите внимание на флуоресцентный краситель. Для удобства подбора фильтров предлагаем ознакомиться со следующими таблицами:

Таблица №1

Таблица №2

В качестве источника света флуоресцентных (люминесцентных) микроскопов используются лампы — ртутные, металлогалидные, галогенные, светодиодные, а также лазеры.

Ртутные лампы – наиболее распространённые осветители для флуоресцентной микроскопии на данный момент, но они могут быть запрещены к закупке через государственные торги РФ с 2018 года. Эти лампы не могут обеспечить равномерную интенсивность в УФ и видимом диапазоне волн, их свечение наиболее интенсивно при длинах волн в 313, 334, 365, 406, 435, 546 и 578нм. Из-за такой пиковой интенсивности они часто используются для УФ возбуждения. У них существуют и проблемы с безопасностью, поэтому не рекомендуется их использование дольше срока годности, иначе они могут взорваться и повредить коллекторную линзу.

У галогенных ламп схожие с ртутными лампами проблемы, но вдвое-вчетверо больший ресурс. Тем не менее, из-за низкой интенсивности и отсутствия УФ части спектра они не так широко распространены как ртутные лампы.

Светодиодные лампы стали применять сравнительно недавно для флуоресцентной микроскопии. Они не требуют юстировки, полностью безопасны, имеют более равномерное распределение интенсивности, чем газоразрядные (ртутные, галогенные). Еще один плюс таких ламп: установив линзы Fly-eye, всё поле зрения будет равномерно освещено.

Лазеры испускают интенсивный когерентный световой пучок, имеющий малую расходимость. Благодаря когерентности пучка света разрешающая способность системы выше. Поэтому их используют для конфокальной микроскопии сверхвысокого разрешения.

Заключительный этап конфигурирования флуоресцентного микроскопа – это выбор фотокамеры. Для флуоресценции важно подобрать камеру с высоким динамическим диапазоном (чувствительностью), большим временем экспозиции, малым количеством шумов и большим размером пикселя, потому что каждая линза в оптическом пути микроскопа поглощает часть света, и на матрицу камеры попадает мало света. Да и само флуоресцентное свечение неравномерно. Наш мозг выполняет роль выдержки в камере и собирает усредненную картину флуоресценции, а камере необходимо время, чтобы на матрицу попало достаточно количество света от образца.

Камеры с пзс (ccd) матрицами и активным охлаждением предпочтительнее для слабой флуоресценции, потому что их матрицы чувствительнее кмоп (cmos) и меньше подвержены цифровым шумам.

Да, быстродействие (количество кадров в секунду) CCD камеры будет немного ниже, чем у CMOS, но для флуоресценции это не имеет решающего значения.

Современное программное обеспечение камер состоит из различных модулей. Для флуоресценции наиболее полезными окажутся модули сшивки изображения, подсчёта численности объектов, FRAP и FRET анализ (совмещение и наложение) флуоресцентных снимков. Все эти модули есть в программном обеспечении CellSens и BZ analyser.

Поскольку в конфокальной микроскопии тоже используют флуоресценцию, то уточним, что всё вышесказанное относится именно к эпифлуоресценции. Приведем краткий исторический очерк:

Первый эпифлуоресцентный микроскоп, в котором была решена проблема разделения возбуждающего света и флуоресцентного сигнала был сконструирован в 1929 году.

Этот микроскоп отличался от предыдущих щелевых флуоресцентных микроскопов тем, что детекция флуоресцентного сигнала осуществлялась только со стороны образца, поэтому наблюдатель видел только эмиссию света от флуорофора. С течением времени расширилась область применения таких микроскопов,например, флуоресцентные микроскопы стали использовать в материаловедении, для выявления дефектов поверхности, содержания полимеров в битуме, анализа краски и других. Возросшее разрешение флуоресцентных микроскопов позволяет вести более точную детекцию сигнала и получать более информативные изображения.Снимки стали информативнее, благодаря наложению изображений, снятых с использованием разных фильтров.

Микроскопия зародилась в Германии, и самые известные производители микроскопов Европы имеют немецкие корни. Однако,с конца двадцатого века, японские производители стали активно и на равных конкурировать с классической немецкой школой микроскопостроения.

Среди микроскопов классической немецкой школы особенно выделяются: Hund H600 FL, оснащённый слайдером с пятью блоками фильтров и ртутной лампой, а также Hund Wilovert AFL – инвертированный микроскоп с 100Вт ртутной лампой.

Японские производители микроскопов: корпорация Olympus – выпустившая первый серийный микроскоп в Азии, входящая в рейтинг лучших производителей оптики и компания Keyence – выпускающая роботизированные микроскопы для высокотехнологичных и точных производств.

Модели Olympus для флуоресценции:

  • Лабораторный флуоресцентный микроскоп CX43 со светодиодным (LED) флуоресцентным модулем (с одним блоком фильтров).
  • Исследовательские флуоресцентные микроскопы BX43, BX53 и BX63 оснащаются флуоресцентным светодиодным/ртутным или ксеноновым осветителем с турелью для восьми(маленьких) и шести (больших).блоков-фильтров.
  • Инвертированный лабораторный флуоресцентный микроскоп CKX53 – комплектуется флуоресцентным модулем на 2 блока фильтров.
  • Инвертированные исследовательские микроскопы IX73 и IX83 – оснащаются флуоресцентным модулем на 6 блок-фильтров. IX83 – может быть переоборудован в конфокальную систему.
  • Флуоресцентные микроскопы на основе стереомикроскопов SZX10 и SZX16.

По вопросам консультации и поставки — свяжитесь с нами любым удобным способом:

+7 (495) 234-23-32 

[email protected]

Форма обратной связи

www.microsystemy.ru

Основные понятия и значения во флуоресцентной микроскопии

Введение во флуоресцентную микроскопию

Поглощение и последующее переизлучение света органическими и неорганическими образцами обычно является результатом распространённого физического явления, называемого либо флуоресценцией, либо фосфоресценцией. Испускание света посредством флуоресценции происходит почти одновременно с поглощением возбуждающего света, благодаря относительно малому времени задержки между поглощением и испусканием фотона, которое обычно не превышает микросекундного интервала. При более длительном интервале между поглощением и испусканием света это явление называется фосфоресценцией.

Рис. 1. Эпи-флуоресцентный микроскоп

Впервые флуоресценция была описана в 1852 году британским учёным Джорджем Стоксом, который и ввёл в употребление этот термин при проведении экспериментов с флюоритом (плавиковым шпатом), испускающим красный свет при облучении ультрафиолетом. Стокс заметил, что длина волны флуоресцентного испускания всегда больше длины волны света возбуждения. Первые исследования в 19-м веке показали, что многие образцы (включая минералы, кристаллы, смолы, лекарственное сырьё, масла, хлорофилл, витамины и неорганические соединения) флуоресцируют при облучении их ультрафиолетом. Тем не менее, применение флуорохромов в биологических исследованиях для окрашивания компонентов тканей, бактерий и других болезнетворных организмов началось лишь в 1930-х годах. Некоторые из этих красителей были крайне специфичны и стимулировали развитие флуоресцентной микроскопии.

Благодаря некоторым показателям, трудно достижимым традиционной контрастной оптической микроскопией, флуоресцентная микроскопия стала важным инструментом как в биологических и биомедицинских исследованиях, так и в материаловедении. Применение наборов флуорохромов позволило выделять высоко специфичные клетки и субмикроскопические клеточные компоненты среди не флуоресцирующих веществ. С помощью флуоресцентного микроскопа, на самом деле, можно обнаруживать даже отдельные молекулы. С помощью флуоресцентного мультиокрашивания различные красители могут идентифицировать несколько молекул-мишеней одновременно. И хотя пространственное разрешение флуоресцентного микроскопа ограничено снизу дифракционным пределом, зависящим от специфических характеристик образца, обнаружение флуоресцирующих молекул ниже этого предела вполне возможно.

Многие образцы, будучи облучёнными, демонстрируют автофлуоресценцию (без применения флуорохромов), и это явление широко используется в ботанике, петрологии и полупроводниковой промышленности. И напротив, изучение тканей животных или болезнетворных организмов часто осложнено либо чрезвычайно слабой, либо, наоборот, сильной неспецифичной автофлуоресценцией. Гораздо более важное значение в этом случае имеет внесение в ткани флуорохромов (или флуророфоров), возбуждаемых на определённой длине волны и испускающих свет с необходимой интенсивностью. Флуорохромы являются красителями, которые, самостоятельно прикрепляясь к видимым или невидимым структурам, обладают при этом высокой избирательностью по отношению к мишеням и высоким квантовым выходом (отношением числа испущенных к числу поглощённых фотонов). Бурный рост применения флуоресцентной микроскопии тесно связан с появлением новых синтетических и естественных флуорофоров, имеющих определённые профили интенсивности возбуждения и испускания и «нацеленных» на заданные биологические мишени.

Основы процессов возбуждения и испускания

Принцип работы флуоресцентного микроскопа заключается в облучении образца на длинах волн в необходимом и точно определённом интервале с последующим выделением гораздо более слабой испускаемой флуоресценции из потока возбуждающего света. В хорошо настроенном микроскопе достигать глаза или приёмного устройства должен лишь испускаемый свет, таким образом, чтобы наблюдаемые флуоресцирующие структуры накладывались на высоко контрастный очень тёмный (или чёрный) фон. Темнота фона, в общем, определяет пределы обнаружения, поскольку возбуждающий свет обычно в сотни тысяч, или даже миллионы, раз ярче испускаемой флуоресценции.

На рисунке 1 схематически изображён в разрезе современный эпифлуоресцентный микроскоп, предназначенный для наблюдений как в проходящем, так и в отражённом свете. Вертикальный осветитель, расположенный в центре, на одном конце имеет источник света (обозначенный на схеме как эпископический модуль) и насадку с фильтрами — на другом. В основе конструкции лежит микроскоп, работающий в отражённом свете, длина волны которого больше длины волны возбуждения. Автором вертикального осветителя для флуоресцентной микроскопии в отражённом свете считается Джон С. Плоем (Johan S. Ploem). Многочастотный свет от дуговой лампы или другого источника, проходя через селективный светофильтр возбуждения, преобразуется во флуоресцентном вертикальном осветителе в свет с определённой длиной волны (или в заданном волновом интервале), обычно из ультрафиолетового, синего или зелёного участков спектра. Пропущенный фильтром возбуждения поток отражается от поверхности дихроматического (также называемого дихроичным) зеркала или светоделителя и, пройдя через объектив, освещает образец интенсивным светом. Если образец флуоресцирует, испускаемый свет, собираемый объективом, опять проходит через дихроичное зеркало, после чего фильтруется запирающим (или эмиссионным) фильтром, который блокирует свет на длинах волн возбуждения. Важно заметить, что флуоресценция является единственным в оптической микроскопии режимом, при котором образец после облучения излучает свой собственный свет. Испускаемый свет переизлучается сферически во всех направлениях, независимо от расположения источника облучающего света.

Метод эпифлуоресцентного освещения является преобладающим в современной микроскопии. Вертикальный осветитель отражённого света располагается между тубусами наблюдения и револьверной головкой объективов. Осветитель устроен таким образом, что возбуждающий свет на пути к образу и от образца проходит через один и тот же объектив микроскопа, который в данной конфигурации сначала выступает в качестве конденсора, а на обратном пути собирает испущенный свет флуоресценции. Осветители этого типа имеют несколько преимуществ. Объектив флуоресцентного микроскопа выступает, во-перых, в качестве хорошо настроенного конденсора, а во-вторых, в качестве собирающего свет устройства, с помощью которого формируется изображение. Будучи одним и тем же компонентом, объектив/конденсор всегда превосходно отюстирован. Большая часть возбуждающего света, достигающего образца, проходит сквозь него без взаимодействия и не возвращается на объектив, а освещаемая область ограничена той частью образца, которая наблюдается через окуляры (в большинстве случаев). Если микроскоп правильно сконфигурирован для освещения по Кёллеру, то, в отличие от некоторых методов, усиливающих контраст, при наблюдении на нём доступна полная числовая апертура объектива. Кроме того, он позволяет комбинировать режимы наблюдения в проходящем и отражённом свете, режим формирования цифрового изображения, или выбирать один из них.

Рис. 2. Флуоресцентные фильтры

Как показано на рисунке 1, на заднем конце вертикального осветителя отражённого света расположен блок дуговой лампы (обычно ртутной или ксеноновой). Распространяясь вдоль осветителя перпендикулярно оптической оси микроскопа, возбуждающий свет проходит сквозь собирающие линзы, регулируемую и центрируемую апертурную диафрагму, а затем через регулируемую центрируемую полевую диафрагму (см. рисунок 1). После этого свет попадает на фильтр возбуждения, где происходит отбор длин волн из требуемого интервала и блокирование остальных длин волн. После прохождения фильтра возбуждения, отобранные длины волн достигают дихроичного светоделительного зеркала, являющегося специальным интерференционным фильтром, эффективно отражающим коротковолновый и эффективно пропускающим длинноволновый свет. Дихроичный светоделитель наклонён под углом 45 градусов по отношению к падающему на него возбуждающему свету и отражает его под углом 90 градусов через объектив оптической системы прямо на образец. Флуоресценция, испускаемая освещённым образцом, собирается объективом, выполняющим теперь уже свою обычную функцию, а именно формирование изображения. Поскольку испускаемые длины волн больше длин волн возбуждения, они проходят через дихроичное зеркало вверх к наблюдательным тубусам или электронному детектору.

Большинство рассеянного возбуждающего света, достигая дихроичного зеркала, отражается им обратно к световому источнику, хотя небольшая его доля может пройти насквозь или поглощается внутренним покрытием зеркала. Но до того, как испущенная флуоресценция достигнет окуляра или детектора, она должна пройти запирающий или заграждающий фильтр Эти фильтры блокируют (заграждают) любой остаточный возбуждающий свет, но пропускают более длинные волны испускаемого света. В большинстве осветителей отражённого света фильтр возбуждения, дихроичное зеркало и запирающий фильтр объединены в оптический бл

www.stormoff.ru

Отправить ответ

avatar
  Подписаться  
Уведомление о